Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rad1: sc-403600-ACT

Le gène humain **RAD1** code Rad1, un composant central de la pince de point de contrôle **RAD9A–HUS1–RAD1 (9-1-1)**, qui est chargée sur l’ADN endommagé afin de coordonner la surveillance du génome. Rad1 soutient la signalisation médiée par **ATR**, favorise la stabilité des fourches de réplication et interagit avec des voies de réparation de l’ADN, notamment la **réparation par excision de bases** et la **réparation par excision de nucléotides**, pour préserver l’intégrité chromosomique. Par ces fonctions, **RAD1** influence le contrôle des points de contrôle du cycle cellulaire, les réponses au stress réplicatif et la résolution des lésions de l’ADN qui, autrement, entraîneraient une instabilité génomique. Une capacité de contrôle et de réparation dérégulée impliquant le complexe 9-1-1 a été associée, dans des modèles expérimentaux, à des phénotypes de dommages à l’ADN liés au cancer ainsi qu’à une sensibilité au stress génotoxique.

Rad1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAD1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rad1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAD1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAD1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rad1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAD1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rad1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rad1 dans les cellules tumorales présentant une expression de RAD1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.