Rab 33B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404070-ACT

RAB33B codifica Rab 33B, una piccola GTPasi della famiglia Rab che regola eventi di traffico di membrana legati al Golgi e ai compartimenti associati all’autofagia. Alternando gli stati legati a GDP e a GTP, Rab 33B coordina la gemmazione delle vescicole, il trasporto e l’ancoraggio/fusione, supportando lo smistamento del carico e l’omeostasi degli organelli. Il traffico dipendente da RAB33B interseca le vie della macroautofagia e il turnover proteico intracellulare, processi spesso studiati nel contesto della neurodegenerazione, della biologia delle infezioni e delle risposte allo stress delle cellule tumorali. L’interruzione o la deregolazione delle reti di trasporto mediate da Rab può alterare il flusso della via secretoria e la dinamica dell’autofagia, offrendo punti di accesso meccanicistici per ricerche di biologia cellulare rilevanti per la malattia.

Rab 33B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAB33B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rab 33B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAB33B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAB33B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rab 33B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAB33B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rab 33B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rab 33B nelle cellule tumorali con espressione di RAB33B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.