R2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400624-ACT

Humanes **RRM2** kodiert die R2‑Untereinheit der Ribonukleotidreduktase, eines essenziellen Enzyms, das die Umwandlung von Ribonukleotiden in für DNA‑Replikation und ‑Reparatur benötigte Desoxyribonukleotide katalysiert. R2 liefert den di‑eisenhaltigen Tyrosylradikal‑Kofaktor, der den katalytischen Umsatz ermöglicht, und verknüpft damit den Nukleotidstoffwechsel mit dem Fortschreiten der S‑Phase und der Aufrechterhaltung der Genomstabilität. Die RRM2‑Expression wird streng durch Zellzyklus‑ und DNA‑Schadensantwort‑Signalwege reguliert; eine Fehlregulation ist häufig mit proliferativen Phänotypen und Replikationsstress verbunden. Veränderte RRM2‑Aktivität wurde in Zusammenhängen der Tumorbiologie, antiviraler Antworten sowie von Mechanismen untersucht, die das Gleichgewicht der dNTP‑Pools und die Mutagenese beeinflussen.

R2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RRM2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

R2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RRM2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RRM2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen R2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RRM2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von R2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des R2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RRM2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.