PPP1R3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405135-ACT

PPP1R3A kodiert PPP1R3, eine glykogenbindende regulatorische Untereinheit der Proteinphosphatase 1, die dazu beiträgt, die katalytische PP1 an Glykogenpartikel zu rekrutieren und die Dephosphorylierung zentraler Stoffwechselenzyme zu koordinieren. Durch die Modulation der Aktivität von Glykogensynthase und Glykogenphosphorylase trägt PPP1R3A zur Dynamik der Glukosespeicherung bei und verknüpft insulinabhängige Signalwege mit dem Kohlenhydratstoffwechsel in der Skelettmuskulatur und anderen insulinsensitiven Geweben. Eine veränderte Expression oder Regulation von PPP1R3A wurde mit einer gestörten Glykogenverwertung und metabolischen Phänotypen in Verbindung gebracht, was das Gen für Studien zur Insulinsignalisierung, Energiehomöostase und gewebespezifischen metabolischen Anpassung relevant macht. Als scaffold‑ähnlicher PP1‑Regulator ist PPP1R3A zudem ein gut untersuchbarer Knotenpunkt, um Mechanismen der Phosphatase‑Zielsteuerung innerhalb umfassender Phosphorylierungsnetzwerke zu analysieren.

PPP1R3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PPP1R3A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PPP1R3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PPP1R3A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PPP1R3A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PPP1R3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PPP1R3A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PPP1R3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PPP1R3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PPP1R3A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.