PPP1R3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405135-ACT

PPP1R3A codifica PPP1R3, una subunità regolatoria di protein fosfatasi 1 (PP1) che indirizza l’enzima verso il glicogeno, contribuendo a localizzare la PP1 catalitica sulle particelle di glicogeno e a coordinare la defosforilazione di enzimi metabolici chiave. Modulando l’attività della glicogeno sintasi e della fosforilasi, PPP1R3A contribuisce alla dinamica dell’immagazzinamento del glucosio e integra la segnalazione responsiva all’insulina con il metabolismo dei carboidrati nel muscolo scheletrico e in altri tessuti sensibili all’insulina. Alterazioni dell’espressione o della regolazione di PPP1R3A sono state associate a una gestione disfunzionale del glicogeno e a fenotipi metabolici, rendendolo rilevante per studi sulla segnalazione insulinica, sull’omeostasi energetica e sull’adattamento metabolico specifico dei tessuti. In quanto regolatore di PP1 con funzione di impalcatura (scaffold), PPP1R3A rappresenta anche un nodo sperimentale accessibile per analizzare i meccanismi di indirizzamento delle fosfatasi all’interno di reti di fosforilazione più ampie.

PPP1R3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PPP1R3A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PPP1R3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PPP1R3A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PPP1R3A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PPP1R3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PPP1R3A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PPP1R3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PPP1R3 nelle cellule tumorali con espressione di PPP1R3A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.