PPOX Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-410546-ACT

A PPOX (protoporfirinogênio oxidase) humana é uma enzima da membrana interna mitocondrial que catalisa a oxidação do protoporfirinogênio IX a protoporfirina IX, uma etapa tardia fundamental na biossíntese do heme. Ao controlar o fluxo de porfirinas, a PPOX sustenta a produção de hemoproteínas e o equilíbrio redox celular, conectando o metabolismo mitocondrial ao manejo de oxigênio e às respostas ao estresse oxidativo. A interrupção ou desregulação da atividade da PPOX altera a homeostase de porfirinas e está associada a fenótipos de porfiria caracterizados por acúmulo anormal de porfirinas. Por isso, a PPOX é amplamente estudada em vias que regulam o metabolismo de heme/porfirinas, a função mitocondrial e a sinalização de estresse metabólico.

PPOX O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PPOX sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PPOX O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PPOX em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PPOX, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PPOX. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PPOX nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PPOX no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PPOX em células tumorais com expressão de PPOX silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.