Plásmido CRISPR de Activación (m) PP2Cκ: sc-433975-ACT

Ppm1k codifica la fosfatasa mitocondrial PP2Cκ, una enzima de la familia PP2C dependiente de Mg2+/Mn2+ que regula el metabolismo oxidativo al desfosforilar dianas clave implicadas en el catabolismo de los aminoácidos de cadena ramificada (BCAA). En particular, PP2Cκ modula la actividad del complejo deshidrogenasa de α-cetoácidos de cadena ramificada (BCKDH), vinculando el flujo mitocondrial de nutrientes con la homeostasis energética celular. Debido a sus efectos sobre el uso de BCAA y la función mitocondrial, Ppm1k se estudia en contextos de respuestas al estrés metabólico y bioenergética específica de tejidos, incluidos modelos relevantes para la sensibilidad a la insulina, el metabolismo del tejido adiposo y del músculo, y fenotipos asociados a disfunción mitocondrial. La desregulación de esta vía se asocia, en sistemas experimentales, con alteraciones de la homeostasis de aminoácidos y con estados de señalización vinculados a enfermedades metabólicas.

PP2Cκ El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Ppm1k sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PP2Cκ El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Ppm1k en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Ppm1k, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PP2Cκ. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Ppm1k y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PP2Cκ en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PP2Cκ en células tumorales con expresión de Ppm1k silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.