PP2Cα Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403960-ACT

PPM1A codifica la fosfatasi serina/treonina PP2Cα, un membro della famiglia PP2C dipendente da Mg²⁺/Mn²⁺ che controbilancia la segnalazione delle chinasi attivate dallo stress defosforilando componenti chiave della via. PP2Cα modula le risposte cellulari a stimoli genotossici e infiammatori, con ruoli descritti nella regolazione delle cascate MAPK, degli output di segnalazione collegati a NF-κB e del controllo dei checkpoint del ciclo cellulare. Regolando finemente le soglie di segnalazione dipendenti dalla fosforilazione, PPM1A influenza apoptosi, differenziamento e programmi dell’immunità innata. Un’attività o un’espressione deregolata di PP2Cα è stata associata ad alteramenti dell’adattamento allo stress e a fenotipi di segnalazione osservati in diversi contesti rilevanti per la malattia, inclusi la biologia del cancro e patologie immuno-correlate.

PP2Cα Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PPM1A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PP2Cα Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PPM1A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PPM1A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PP2Cα. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PPM1A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PP2Cα nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PP2Cα nelle cellule tumorali con espressione di PPM1A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.