Plásmido CRISPR de Activación (h) PORCN: sc-413044-ACT

El PORCN humano codifica una O-aciltransferasa de membrana localizada en el retículo endoplásmico que cataliza la palmitoleoilación de ligandos WNT, una modificación necesaria para la secreción de WNT, la formación de gradientes extracelulares y la interacción con receptores. A través de este paso esencial de procesamiento, PORCN regula la señalización WNT canónica y no canónica, influyendo en la transcripción dependiente de β-catenina, la especificación del destino celular, la proliferación y el patrón tisular. La alteración de la salida de WNT dependiente de PORCN se asocia con anomalías del desarrollo y enfermedades caracterizadas por una actividad desregulada de la vía WNT, lo que respalda su uso en estudios mecanísticos de programas de diferenciación y de reconfiguración de redes de señalización. La función de PORCN también es relevante para estudios de homeostasis epitelial, biología de células madre y crosstalk entre vías que afecta la morfogénesis y estados de señalización oncogénica.

PORCN El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PORCN sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PORCN El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PORCN en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PORCN, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PORCN. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PORCN y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PORCN en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PORCN en células tumorales con expresión de PORCN silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.