PON2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403181-ACT

La PON2 umana (paraoxonasi 2) è una lattonasi associata alla membrana, espressa in modo ubiquo, con attività antiossidante che limita la perossidazione lipidica e contribuisce a preservare l’integrità di membrana in condizioni di stress ossidativo. PON2 modula l’omeostasi redox e la funzione mitocondriale attenuando la generazione di specie reattive dell’ossigeno e influenzando la segnalazione della risposta allo stress, incluse vie collegate all’infiammazione e alla regolazione metabolica. Alterazioni dell’espressione e dell’attività di PON2 sono state associate a processi rilevanti per l’aterosclerosi, la resistenza all’insulina e la sopravvivenza delle cellule tumorali, in cui variazioni dell’equilibrio ossidativo possono rimodellare la fitness cellulare e gli output di segnalazione. Di conseguenza, PON2 è spesso studiata in modelli di disfunzione endoteliale, biologia dei macrofagi, stress mitocondriale e fenotipi guidati dal danno ossidativo.

PON2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PON2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PON2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PON2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PON2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PON2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PON2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PON2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PON2 nelle cellule tumorali con espressione di PON2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.