Plásmido CRISPR de Activación (m) podoplanin: sc-420632-ACT

El gen Pdpn de ratón codifica la podoplanina, una glucoproteína transmembrana de tipo mucina expresada en células endoteliales linfáticas, células reticulares fibroblásticas y determinados compartimentos epiteliales, donde regula la forma celular, la adhesión y la motilidad direccional. La podoplanina interactúa con el receptor plaquetario CLEC-2 para influir en la remodelación del citoesqueleto mediante la señalización RhoA/ROCK y coordina la dinámica de la actina, importante para la linfangiogénesis, la organización tisular y la formación de redes estromales. En el microambiente tumoral, las células estromales y tumorales PDPN-positivas se han asociado con un comportamiento invasivo, la remodelación de la matriz extracelular y la alteración del tráfico de células inmunitarias. La expresión desregulada de PDPN también se asocia con la remodelación inflamatoria y vías relevantes para la fibrosis, lo que la convierte en un objetivo útil para estudios mecanísticos de la biología vascular y estromal.

podoplanin El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Pdpn sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

podoplanin El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Pdpn en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Pdpn, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de podoplanin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Pdpn y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de podoplanin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía podoplanin en células tumorales con expresión de Pdpn silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.