Plásmido CRISPR de Activación (h) Podocin: sc-400930-ACT

NPHS2 codifica la podocina, una proteína integral de membrana enriquecida en el diafragma de hendidura de los podocitos renales, donde actúa como andamiaje de componentes de señalización y estructurales necesarios para la integridad de la barrera de filtración glomerular. La podocina interactúa con nefrina y CD2AP dentro de microdominios de balsas lipídicas para sostener la dinámica del citoesqueleto de actina, la mecanosensación y el mantenimiento de uniones celulares especializadas. La alteración de la organización del diafragma de hendidura dependiente de NPHS2 perturba la homeostasis de los podocitos y se asocia fuertemente con fenotipos de enfermedad renal proteinúrica, lo que la convierte en un nodo clave para estudiar el fallo de la barrera de filtración. Por ello, NPHS2 se utiliza ampliamente para investigar la diferenciación de podocitos, las vías de señalización asociadas a las uniones y las relaciones genotipo–fenotipo en la biología glomerular.

Podocin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de NPHS2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Podocin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus NPHS2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional NPHS2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Podocin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo NPHS2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Podocin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Podocin en células tumorales con expresión de NPHS2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.