PNUTS CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403688-ACT

PPP1R10 kodiert PNUTS (Proteinphosphatase‑1‑Regulatoruntereinheit 10), eine nukleäre Zielsteuerungsuntereinheit, die an PP1 bindet und die Phosphataseaktivität an chromatinassoziierten Substraten moduliert. PNUTS ist an der transkriptionellen Kontrolle, der Signalübertragung der DNA‑Schadensantwort und dem Fortschreiten des Zellzyklus beteiligt, indem es die Dephosphorylierung von Proteinen mit Signalwegen der Genomerhaltung koordiniert. Es wurde mit der Regulation der RNA‑Polymerase‑II‑abhängigen Transkription sowie mit Prozessen in Verbindung gebracht, die die Telomerstabilität und Replikationsstress beeinflussen. Veränderte PPP1R10/PNUTS‑Aktivität wurde mit fehlregulierter Proliferation und Phänotypen genomischer Instabilität assoziiert, die für die Krebsbiologie und andere Erkrankungen mit beeinträchtigter DNA‑Reparatur und nukleärer Signalgebung relevant sind.

PNUTS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PPP1R10-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PNUTS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PPP1R10-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PPP1R10-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PNUTS-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PPP1R10-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PNUTS-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PNUTS-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PPP1R10-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.