Plasmide CRISPR/Cas9 KO PNGase (m): sc-425553

Présentation

Le gène murin **Ngly1** code la peptide:N-glycanase (PNGase), une enzyme cytosolique de déglycosylation qui enlève les glycannes liés en N des glycoprotéines mal repliées rétrotransloquées depuis le réticulum endoplasmique. Cette activité est au cœur de la dégradation associée au RE (ERAD), en couplant la déglycosylation à la dégradation par le système ubiquitine–protéasome et en façonnant la protéostase en situation de stress lié à la réponse aux protéines mal repliées. NGLY1 participe également à la régulation de la maturation de NRF1/NFE2L1, reliant la déglycosylation à des programmes d’adaptation cellulaire qui contrôlent l’expression des gènes du protéasome et la résistance au stress. La perturbation de la fonction N-glycanase est largement pertinente pour comprendre les mécanismes de stress protéotoxique, le contrôle qualité des protéines et les phénotypes neurodéveloppementaux observés dans la biologie liée à NGLY1.

Le plasmide CRISPR/Cas9 KO PNGase (m) est un ensemble de plasmides conçus pour la disruption ciblée du gène Ngly1 dans les lignées cellulaires mouse. Chaque plasmide co-exprime un ARN guide unique (sgRNA) ciblant un site distinct au sein du Ngly1, ainsi que la nucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes. Les plasmides codent également pour la GFP, ce qui permet l'identification par fluorescence et l'enrichissement des cellules transfectées avec succès par microscopie à fluorescence ou cytométrie en flux.

La conception multi-guide augmente la probabilité de générer des insertions ou des délétions (indels) qui perturbent le cadre de lecture ouvert Ngly1 à la suite de la formation de cassures double brin médiées par Cas9. Les cassures d'ADN introduites par le système CRISPR/Cas9 sont réparées par des voies endogènes de jonction non homologue (NHEJ), ce qui entraîne fréquemment des mutations par décalage du cadre de lecture qui suppriment l'expression de la protéine PNGase.

Ce système de knock-out CRISPR permet la génération efficace de modèles cellulaires déficients en Ngly1 pour l'étude de la signalisation de PNGase, les études de génomique fonctionnelle, la recherche en biologie du cancer et l'évaluation des réponses thérapeutiques dans des lignées cellulaires humaines.

Caractéristiques principales

• sgRNA ciblant le ou les exons de Ngly1 essentiels à la fonction de PNGase
  Co-expression de SpCas9 et de sgRNA à partir d'un seul plasmide pour une administration simplifiée
  Rapporteur GFP pour l'identification des cellules transfectées
  Pool de plasmides ciblant plusieurs sites génomiques de Ngly1 pour améliorer l'efficacité du knock-out
  Compatible avec l'administration par transfection

Variantes de conception

CRISPR +/- HDR

• Les gRNA codés par le PNGase plasmide CRISPR/Cas9 KO (m) et le PNGase plasmide CRISPR/Cas9 KO (m2) ciblent des sites distincts au sein du locus Ngly1. Une ou les deux conceptions de ciblage peuvent être disponibles. Voir les produits associés pour connaître la disponibilité.
  Les constructions donneuses HDR codées par le PNGase plasmide HDR (m) et le PNGase (m2) contiennent une cassette de résistance à la puromycine et un rapporteur RFP flanqué de bras d'homologie Ngly1 pour permettre la réparation dirigée par homologie au niveau de sites cibles Ngly1 définis correspondant aux conceptions CRISPR/Cas9 KO. La disponibilité des donneurs HDR peut varier. Voir les produits associés pour connaître la disponibilité.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.