PMCA4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402888-ACT

ATP2B4 kodiert die Plasma­membran‑Ca2+-ATPase 4 (PMCA4), eine hochaffine P‑Typ‑ATPase, die zytosolisches Ca2+ exportiert, um die Calciumhomöostase aufrechtzuerhalten und räumlich‑zeitliche Ca2+-Signale zu formen. Durch die Feinabstimmung der intrazellulären Ca2+-Dynamik beeinflusst PMCA4 die Erregungs‑Kontraktions‑Kopplung, die Stickstoffmonoxid‑Signalgebung durch räumliche Nähe zur endothelialen NO‑Synthase sowie nachgeschaltete Transkriptionsprogramme, die von Ca2+-responsiven Signalwegen wie Calcineurin–NFAT und CaMK gesteuert werden. Die PMCA4‑Aktivität trägt über die Kontrolle Ca2+-abhängiger Enzyme und Ionenkanäle zur Regulation des Membranpotenzials, der Zellmigration und der Anfälligkeit für Apoptose bei. Eine fehlregulierte Expression oder Funktion von ATP2B4/PMCA4 wurde in genetischen und mechanistischen Studien mit kardiovaskulären und erythroiden Phänotypen in Verbindung gebracht, was ihre Relevanz für die Modellierung Ca2+-getriebener Biologie in menschlichen Zellen unterstreicht.

PMCA4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ATP2B4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PMCA4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ATP2B4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ATP2B4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PMCA4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ATP2B4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PMCA4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PMCA4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ATP2B4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.