Plásmido CRISPR de Activación (h) PLUNC: sc-416774-ACT

BPIFA1 codifica PLUNC (clon del epitelio del paladar, pulmón y epitelio nasal), una proteína secretada de la inmunidad innata enriquecida en el epitelio de las vías aéreas superiores y en el líquido de la superficie de las vías respiratorias. PLUNC contribuye a la defensa del huésped en las mucosas al modular la actividad antimicrobiana, influir en la formación de biopelículas y regular la tensión superficial de las vías respiratorias y la homeostasis de la barrera epitelial. La expresión de BPIFA1 está vinculada a programas de diferenciación epitelial y a la señalización inflamatoria en el tracto respiratorio, lo que la hace relevante para estudios de inflamación crónica de las vías respiratorias y de la biología de las infecciones. Se han asociado niveles alterados de PLUNC con enfermedades de las vías aéreas caracterizadas por una inmunidad mucosal desregulada, como el asma, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y la rinosinusitis crónica.

PLUNC El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de BPIFA1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PLUNC El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus BPIFA1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional BPIFA1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PLUNC. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo BPIFA1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PLUNC en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PLUNC en células tumorales con expresión de BPIFA1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.