Plásmido CRISPR de Activación (h) PLAP: sc-400629-ACT

ALPP codifica la fosfatasa alcalina placentaria (PLAP), una ectoenzima anclada a glicosilfosfatidilinositol (GPI) que desfosforila sustratos extracelulares y contribuye a la homeostasis del fosfato en la superficie celular. La actividad de PLAP se asocia con la organización de microdominios de membrana, la modulación de la señalización purinérgica mediante la desfosforilación de nucleótidos y un control más amplio del metabolismo extracelular de fosfomonoésteres. En tejidos humanos, ALPP es especialmente prominente en la placenta y se utiliza con frecuencia como marcador asociado a la diferenciación en la biología del trofoblasto y en contextos relacionados con células germinales. Se ha descrito una expresión desregulada de ALPP/PLAP en múltiples escenarios relevantes para enfermedades, lo que respalda su utilidad para estudiar programas de linaje, la función de enzimas de superficie celular y estados de expresión asociados a tumores en modelos experimentales.

PLAP El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ALPP sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PLAP El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ALPP en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ALPP, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PLAP. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ALPP y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PLAP en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PLAP en células tumorales con expresión de ALPP silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.