PKC mu Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401070-ACT

PRKD1 codifica a proteína quinase D1 (PKC mu), uma quinase de serina/treonina ativada a jusante do diacilglicerol e da sinalização de PKCs novas, que coordena o controlo dependente de fosforilação do tráfego de membranas, da remodelação do citoesqueleto e de programas transcricionais. A PKC mu participa em vias que ligam sinais provenientes de GPCRs e de recetores tirosina-quinase à sinalização MAPK, a respostas associadas ao NF-κB e à regulação da sobrevivência e motilidade celular. Em células humanas, a atividade de PRKD1 tem sido associada à modulação da polaridade epitelial, ao transporte secretório a partir da rede trans-Golgi e a redes de sinalização responsivas ao stress. Foi descrita sinalização desregulada de PRKD1 em múltiplos contextos relevantes para doenças, incluindo fenótipos proliferativos e migratórios alterados e sinalização inflamatória, sustentando o seu uso como um nó mecanístico na investigação de vias.

PKC mu O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PRKD1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PKC mu O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PRKD1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PRKD1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PKC mu. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PRKD1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PKC mu no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PKC mu em células tumorais com expressão de PRKD1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.