Plásmido CRISPR de Activación (h) PKC mu: sc-401070-ACT

PRKD1 codifica la proteína quinasa D1 (PKC mu), una quinasa de serina/treonina activada aguas abajo de la señalización mediada por diacilglicerol y las PKC novedosas, que coordina el control dependiente de fosforilación del tráfico de membranas, la remodelación del citoesqueleto y programas transcripcionales. PKC mu participa en vías que conectan las señales de receptores acoplados a proteína G (GPCR) y de receptores tirosina quinasa con la señalización MAPK, respuestas asociadas a NF-κB y la regulación de la supervivencia y la motilidad celular. En células humanas, la actividad de PRKD1 se ha relacionado con la modulación de la polaridad epitelial, el transporte secretor desde la red trans-Golgi y redes de señalización sensibles al estrés. Se ha informado de una desregulación de la señalización de PRKD1 en múltiples contextos relevantes para enfermedades, incluidos fenotipos proliferativos y migratorios alterados y señalización inflamatoria, lo que respalda su uso como un nodo mecanístico para el análisis de vías.

PKC mu El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PRKD1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PKC mu El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PRKD1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PRKD1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PKC mu. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PRKD1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PKC mu en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PKC mu en células tumorales con expresión de PRKD1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.