PIRT CRISPR Activation Plasmid (h): sc-416125-ACT

Humanes PIRT (phosphoinositid‑interagierender Regulator von TRP‑Kanälen) kodiert ein kleines membranassoziiertes Protein, das an Phosphatidylinositol‑4,5‑bisphosphat (PIP2) bindet und die Aktivität ausgewählter Ionenkanäle der Transient‑Receptor‑Potential‑(TRP-)Familie moduliert. Durch die Regulation TRP‑abhängiger Calcium‑ und Kationenflüsse trägt PIRT zu sensorischen Signalprozessen wie Nozizeption, Thermosensation und Juckreiz bei und verknüpft die Dynamik von Membran‑Phosphoinositiden mit der neuronalen Erregbarkeit. PIRT‑assoziierte Signalgebung überschneidet sich mit Signalwegen, die GPCR‑ und lipidvermittelte Kanal-Gating‑Mechanismen steuern, und beeinflusst nachgeschaltete Second‑Messenger‑Antworten sowie aktivitätsabhängige Transkriptionsprogramme. Eine veränderte Regulation von TRP‑Kanälen und der Phosphoinositid‑Signalgebung wurde mit Schmerz‑ und neuroinflammatorischen Phänotypen in Verbindung gebracht, wodurch PIRT einen nützlichen Angriffspunkt für mechanistische Studien in der Biologie sensorischer Neuronen und in entsprechenden Krankheitsmodellen darstellt.

PIRT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PIRT-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PIRT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PIRT-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PIRT-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PIRT-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PIRT-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PIRT-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PIRT-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PIRT-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.