PIPK I α CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403490-ACT

PIP5K1A kodiert die Phosphatidylinositol-4-phosphat-5-Kinase Typ I Alpha (PIPK I α), eine zentrale Lipidkinase, die an der Plasmamembran und an Endomembranen Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PI(4,5)P2) erzeugt. PI(4,5)P2 dient als Vorläufer für Second Messenger in der Phosphoinositid-Signalübertragung und reguliert direkt den Umbau des Aktin-Zytoskeletts, die clathrinvermittelte Endozytose, den Membrantransport sowie die Dynamik fokaler Adhäsionen. Über die Kontrolle der PI(4,5)P2-Verfügbarkeit beeinflusst PIPK I α Signal-Knotenpunkte wie die PLC/PKC- und die PI3K–AKT-Signalwege und unterstützt die räumliche Organisation rezeptorvermittelter Signalprozesse. Eine dysregulierte Phosphoinositid-Metabolisierung und veränderte PIP5K1A-Aktivität wurden mit abweichender Zellmigration, invasiven Phänotypen und onkogenen Signal-Kontexten in Verbindung gebracht, was das Gen für mechanistische Studien zu Proliferations- und Motilitätsprogrammen relevant macht.

PIPK I α Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PIP5K1A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PIPK I α Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PIP5K1A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PIP5K1A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PIPK I α-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PIP5K1A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PIPK I α-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PIPK I α-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PIP5K1A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.