PINK1 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-427236-LAC

La chinasi 1 putativa indotta da PTEN (PINK1) è una chinasi mitocondriale Ser/Thr che funge da sensore del danno mitocondriale e da principale iniziatore della mitofagia. In seguito alla perdita del potenziale di membrana mitocondriale, PINK1 si accumula sulla membrana mitocondriale esterna, fosforila l’ubiquitina e PRKN/Parkin e promuove la rimozione, dipendente dall’ubiquitina, dei mitocondri disfunzionali. Questa via sostiene il controllo di qualità mitocondriale, regola le risposte allo stress ossidativo e influenza la bioenergetica cellulare, con ampia rilevanza per il mantenimento neuronale e l’omeostasi metabolica. La disregolazione della sorveglianza mitocondriale associata a PINK1 è stata collegata a fenotipi di neurodegenerazione ed è ampiamente studiata in modelli della biologia parkinsoniana e della disfunzione mitocondriale indotta da stress.

Le particelle di attivazione lentivirale PINK1 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Pink1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale PINK1 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Pink1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di PINK1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Pink1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.