PINK1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400739-ACT

PINK1 (PTEN-induzierte mutmaßliche Kinase 1) kodiert eine auf Mitochondrien zielgerichtete Serin/Threonin-Kinase, die als zentraler Sensor für mitochondriale Schäden und als Initiator der Mitophagie fungiert. Bei Verlust des mitochondrialen Membranpotenzials akkumuliert PINK1 an der äußeren Mitochondrienmembran und fördert die Rekrutierung und Aktivierung von PRKN/Parkin. Dadurch koordiniert es die ubiquitinabhängige Entfernung geschädigter Organellen sowie die Umgestaltung der mitochondrialen Dynamik. Dieser Signalweg ist mit zellulären Stressantworten verknüpft, darunter oxidativer Stress, Proteostase und die angeborene Immunaktivierung im Zusammenhang mit mitochondrialer Dysfunktion. Eine veränderte PINK1-Aktivität wurde mit Neurodegeneration und anderen Erkrankungen in Verbindung gebracht, die durch eine gestörte mitochondriale Qualitätskontrolle gekennzeichnet sind, was PINK1 zu einem häufig genutzten Ziel in Studien zur mitochondrialen Homöostase macht.

PINK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PINK1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PINK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PINK1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PINK1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PINK1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PINK1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PINK1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PINK1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PINK1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.