Pi16 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-428732-ACT

Der murine Peptidase-Inhibitor 16 (Pi16) kodiert ein sezerniertes, einem Serinprotease-Inhibitor ähnliches Protein, das an der Regulation der extrazellulären Proteolyse und des perizellulären Matrix-Remodelings beteiligt ist. Die Pi16-Expression ist in stromalen Kompartimenten und mesenchymalen Zelllinien angereichert, was eine Verbindung zur Fibroblastenbiologie, zu Gewebereparaturprogrammen und zur Modulation von Zell-Matrix-Interaktionen nahelegt, die Migration und Differenzierung beeinflussen. Über seine Effekte auf Proteaseaktivität und die Verfügbarkeit extrazellulärer Signale ist Pi16 für Signalwege relevant, die entzündungsassoziiertes Remodeling und fibrotische Antworten steuern. Fehlreguliertes stromales Remodeling und ein verändertes Protease/Inhibitor-Gleichgewicht sind wiederkehrende Merkmale in Modellen kardiovaskulärer und pulmonaler Erkrankungen, wodurch Pi16 als nützlicher Knotenpunkt für mechanistische Studien zur Regulation des Mikromilieus positioniert ist.

Pi16 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Pi16-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Pi16 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Pi16-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Pi16-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Pi16-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Pi16-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Pi16-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Pi16-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Pi16-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.