PHF5A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-407986-ACT

PHF5A (PHD-Finger-Protein 5A) ist eine konservierte Komponente des SF3b-Subkomplexes des U2-snRNP und unterstützt den Aufbau des Spleißosoms sowie die Genauigkeit des prä‑mRNA-Spleißens. Durch die Stabilisierung der Erkennung des Branchpoints und der 3′-Spleißstelle trägt PHF5A zur Auswahl von Transkript-Isoformen bei, die den Zellzyklusverlauf, DNA-Schadensantworten und Differenzierungsprogramme beeinflusst. Eine Störung des PHF5A-abhängigen Spleißens kann Genexpressionsnetzwerke umgestalten und wurde mit Verwundbarkeiten in Kontexten dysregulierter RNA-Prozessierung in Verbindung gebracht, einschließlich onkogener Zustände, in denen die Funktion des Spleißosoms unter Stress steht. Als zentraler Spleißfaktor wird PHF5A häufig genutzt, um RNA-Reifungswege und spleißgetriebene Mechanismen zu untersuchen, die phänotypischen Veränderungen zugrunde liegen.

PHF5A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PHF5A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PHF5A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PHF5A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PHF5A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PHF5A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PHF5A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PHF5A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PHF5A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PHF5A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.