Plasmide CRISPR d'Activation (h) PH-4: sc-409966-ACT

Le gène humain **P4HTM** code **PH-4**, une prolyl-4-hydroxylase associée au réticulum endoplasmique (RE) qui catalyse l’hydroxylation de résidus de proline sur des substrats protéiques, une modification post-traductionnelle pouvant influencer le repliement, la stabilité et la sécrétion des protéines. Dans le cadre plus large du réseau des prolyl-hydroxylases, **PH-4** relie une activité enzymatique dépendante de l’oxygène et des métabolites à la protéostasie et aux voies d’adaptation cellulaire. Une chimie d’hydroxylation dérégulée et des altérations du traitement au niveau du RE ont été associées à une signalisation du stress modifiée et à des phénotypes métaboliques, ce qui soutient l’intérêt pour **P4HTM** en tant que nœud reliant l’état rédox, le contrôle qualité des protéines et la régulation de l’état cellulaire. La variation génétique et les changements d’expression de **P4HTM** ont été étudiés dans des contextes impliquant des traits métaboliques et neurodéveloppementaux, ce qui motive des études mécanistiques dans des modèles cellulaires humains pertinents.

PH-4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de P4HTM sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PH-4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus P4HTM dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription P4HTM, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PH-4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus P4HTM natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PH-4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PH-4 dans les cellules tumorales présentant une expression de P4HTM silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.