Peroxin 13 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404060-ACT

PEX13 kodiert Peroxin 13, eine integrale Komponente der peroxisomalen Membran, die für die Biogenese von Peroxisomen und den Import von Matrixproteinen erforderlich ist. Peroxin 13 wirkt innerhalb der peroxisomalen Proteintranslokationsmaschinerie, indem es Peroxine koordiniert, die PTS1-/PTS2-Frachtrezeptoren erkennen, und so den Import von Enzymen unterstützt, die für die β‑Oxidation von Fettsäuren und den Stoffwechsel reaktiver Sauerstoffspezies benötigt werden. Eine Störung von PEX13 beeinträchtigt die peroxisomale Homöostase, verändert Lipidverarbeitung und Redox-Gleichgewicht und ist mit Phänotypen von Peroxisomen-Biogenese-Störungen assoziiert, die mit einer beeinträchtigten Organellenassemblierung zusammenhängen. Humanes PEX13 ist daher ein nützliches Ziel, um in Zellmodellen die Dynamik des peroxisomalen Imports, metabolische Umprogrammierung und Signalwege bei Organellenstress zu untersuchen.

Peroxin 13 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PEX13-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Peroxin 13 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PEX13-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PEX13-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Peroxin 13-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PEX13-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Peroxin 13-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Peroxin 13-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PEX13-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.