Plasmide CRISPR d'Activation (m) PC-1: sc-422179-ACT

La souris Enpp1 code PC-1 (ectonucléotide pyrophosphatase/phosphodiestérase 1), une ectoenzyme transmembranaire de type II qui hydrolyse les nucléotides extracellulaires afin de générer du pyrophosphate inorganique et des métabolites apparentés. En contrôlant l’équilibre ATP–PPi/Pi à la surface cellulaire, PC-1 régule les signaux purinergiques et les programmes de minéralisation de la matrice extracellulaire, influençant la différenciation ostéogénique et la calcification des tissus. L’activité d’Enpp1 s’inscrit à l’interface de voies qui gouvernent l’homéostasie du phosphate et le développement du squelette, et une fonction altérée est associée, dans des systèmes modèles, à des phénotypes de calcification pathologique et à des dérèglements métaboliques. Ces propriétés font d’Enpp1 une cible utile pour étudier la biologie des ectonucléotidases, les mécanismes de biominéralisation et la signalisation dépendante des nucléotides dans des contextes de recherche musculosquelettique et métabolique.

PC-1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Enpp1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PC-1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Enpp1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Enpp1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PC-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Enpp1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PC-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PC-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Enpp1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.