PC-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402336-ACT

ENPP1 codifica l’ectoenzima PC-1 (ecto-nucleotide pirofosfatasi/fosfodiesterasi 1), una glicoproteina transmembrana di tipo II che idrolizza i nucleotidi extracellulari generando AMP e pirofosfato inorganico. Controllando la disponibilità di pirofosfato, PC-1 è un regolatore centrale della mineralizzazione della matrice extracellulare e dei processi biologici della calcificazione, influenzando la segnalazione osteogenica e l’omeostasi tissutale del fosfato. L’attività di ENPP1 si interfaccia inoltre con la segnalazione purinergica tramite la modulazione dei pool di nucleotidi e nucleosidi, plasmando le risposte infiammatorie e metaboliche locali. L’alterazione genetica o funzionale di ENPP1 è associata a patologie di calcificazione ectopica e di mineralizzazione scheletrica, e l’espressione modificata di PC-1 è stata studiata anche in contesti di malattie metaboliche, inclusa la disregolazione della segnalazione insulinica.

PC-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ENPP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PC-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ENPP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ENPP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PC-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ENPP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PC-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PC-1 nelle cellule tumorali con espressione di ENPP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.