PC-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402336-ACT

ENPP1 kodiert das Ektoenzym PC-1 (Ectonukleotid-Pyrophosphatase/Phosphodiesterase 1), ein Typ-II-Transmembran-Glykoprotein, das extrazelluläre Nukleotide hydrolysiert und dabei AMP sowie anorganisches Pyrophosphat bildet. Durch die Kontrolle der Pyrophosphatverfügbarkeit ist PC-1 ein zentraler Regulator der Mineralisierung der extrazellulären Matrix und der Biologie der Kalzifizierung; es beeinflusst osteogene Signalwege und die Phosphathomöostase im Gewebe. Die ENPP1-Aktivität steht zudem über die Modulation von Nukleotid- und Nukleosid-Pools in Wechselwirkung mit purinergen Signalwegen und prägt dadurch lokale entzündliche und metabolische Antworten. Eine genetische oder funktionelle Störung von ENPP1 wird mit Erkrankungen durch ektopische Kalzifizierung und gestörter Skelettmineralisierung in Verbindung gebracht, und veränderte PC-1-Expression wurde auch im Kontext metabolischer Erkrankungen untersucht, einschließlich einer Dysregulation der Insulinsignalübertragung.

PC-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ENPP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PC-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ENPP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ENPP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PC-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ENPP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PC-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PC-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ENPP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.