PARD6A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401184-ACT

PARD6A codifica la proteina partitioning defective 6 homolog alpha, un componente chiave del complesso di polarità PAR che coopera con PAR3 e la PKC atipica per stabilire la polarità apico‑basale e regolare la divisione cellulare asimmetrica. Coordinando l’assemblaggio delle tight junctions, l’organizzazione del citoscheletro e il traffico vescicolare, PARD6A influenza la morfogenesi epiteliale, la migrazione cellulare e il mantenimento dell’architettura tissutale differenziata. L’alterazione della segnalazione del complesso PAR è stata collegata a una compromissione dell’integrità delle giunzioni e a programmi di proliferazione modificati, processi frequentemente associati alla tumorigenesi e alla progressione metastatica. PARD6A è quindi ampiamente studiato in modelli di perdita della polarità epiteliale, invasione e cross‑talk di segnalazione che coinvolge piccole GTPasi e vie chinasi che controllano l’architettura cellulare.

PARD6A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PARD6A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PARD6A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PARD6A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PARD6A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PARD6A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PARD6A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PARD6A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PARD6A nelle cellule tumorali con espressione di PARD6A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.