Plásmido CRISPR de Activación (h) PARD6A: sc-401184-ACT

PARD6A codifica la proteína homóloga alfa de partitioning defective 6, un componente central del complejo de polaridad PAR que coopera con PAR3 y la PKC atípica para establecer la polaridad apical–basal y regular la división celular asimétrica. Mediante la coordinación del ensamblaje de las uniones estrechas, la organización del citoesqueleto y el tráfico vesicular, PARD6A influye en la morfogénesis epitelial, la migración celular y el mantenimiento de la arquitectura tisular diferenciada. La alteración de la señalización del complejo PAR se ha vinculado con la pérdida de integridad de las uniones y con programas de proliferación modificados, procesos que con frecuencia se asocian a la tumorogénesis y la progresión metastásica. Por ello, PARD6A se estudia ampliamente en modelos de pérdida de polaridad epitelial, invasión e interacciones de señalización (cross-talk) que involucran pequeñas GTPasas y vías de quinasas que controlan la arquitectura celular.

PARD6A El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PARD6A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PARD6A El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PARD6A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PARD6A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PARD6A. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PARD6A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PARD6A en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PARD6A en células tumorales con expresión de PARD6A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.