PAR-4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401719-ACT

F2RL3 kodiert den proteaseaktivierten Rezeptor 4 (PAR-4), einen G‑Protein-gekoppelten Rezeptor, der durch Thrombin und andere Serinproteasen aktiviert wird, indem durch proteolytische Spaltung ein „tethered ligand“ (tethered Ligand) freigelegt wird. Die PAR‑4-Signalübertragung aktiviert die Gq- und G12/13-Wege und stimuliert dadurch die Aktivität der Phospholipase C, die Mobilisierung von intrazellulärem Ca2+, die RhoA/ROCK-Signalkaskade sowie nachgeschaltete MAPK- und NF‑κB-abhängige Transkriptionsprogramme. In Thrombozyten und gefäßassoziierten Zellen regulieren diese Kaskaden Aktivierung, Sekretion, Zytoskelett-Remodelling und entzündliche Crosstalk-Signale. Eine dysregulierte PAR‑4-Aktivität und veränderte F2RL3-Expressionsmuster wurden mit thrombose-relevanter Biologie, vaskulärer Entzündung und Signalprozessen im krebsassoziierten Mikromilieu in Verbindung gebracht und stützen mechanistische Studien zur Hämostase sowie zu Tumor‑Stroma-Interaktionen.

PAR-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen F2RL3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PAR-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des F2RL3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der F2RL3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PAR-4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native F2RL3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PAR-4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PAR-4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem F2RL3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.