PAM Plasmide KO CRISPR/Cas9 (m): sc-422110

Panoramica

La monoossigenasi peptidilglicina alfa-amidante (PAM), codificata nel topo dal gene *Pam*, è un enzima bifunzionale che catalizza l’amidazione al C-terminale di numerosi neuropeptidi e ormoni peptidici, una modifica necessaria per la piena bioattività. Questa via dipendente da rame e ascorbato sostiene la maturazione dei peptidi lungo la via secretoria e influenza la secrezione regolata nelle cellule neuroendocrine e neuronali. L’attività di *Pam* collega la biogenesi delle vescicole e la funzione dei granuli secretori alle reti di segnalazione dei neuropeptidi che modulano la trasmissione sinaptica, le risposte allo stress, il metabolismo e l’omeostasi cardiovascolare. Alterazioni dell’amidazione dei peptidi e cambiamenti della funzione di PAM sono stati associati a fenotipi neurosviluppo e neuropsichiatrici, a squilibri endocrini e a tratti cardiometabolici, rendendo *Pam* un locus utile per studi meccanicistici della biologia della via secretoria.

Il plasmide CRISPR/Cas9 KO PAM (m) è un pool di plasmidi progettato per la distruzione mirata del gene Pam in linee cellulari mouse. Ciascun plasmide co-esprime un singolo RNA guida (sgRNA) unico che prende di mira un sito distinto all'interno del Pam insieme alla nucleasi Cas9 di Streptococcus pyogenes. I plasmidi codificano anche per la GFP, consentendo l'identificazione fluorescente e l'arricchimento delle cellule trasfettate con successo tramite microscopia a fluorescenza o citometria a flusso.

Il design multi-guida aumenta la probabilità di generare inserzioni o delezioni (indels) che interrompono il frame di lettura aperto Pam a seguito della formazione di rotture a doppio filamento mediate da Cas9. Le rotture del DNA introdotte dal sistema CRISPR/Cas9 vengono riparate attraverso vie endogene di giunzione non omologa (NHEJ), che spesso provocano mutazioni con spostamento del frame che annullano l'espressione della proteina PAM.

Questo sistema di knockout CRISPR consente la generazione efficiente di modelli cellulari carenti di Pam per lo studio della segnalazione di PAM, studi di genomica funzionale, ricerca sulla biologia del cancro e valutazione delle risposte terapeutiche in linee cellulari umane.

Caratteristiche principali

• sgRNA mirati agli esoni Pam critici per la funzione di PAM
  Co-espressione di SpCas9 e sgRNA da un singolo plasmide per una somministrazione semplificata
  Reporter GFP per l'identificazione delle cellule trasfettate
  Pool di plasmidi mirati a più siti genomici di Pam per migliorare l'efficienza del knockout
  Compatibile con la somministrazione tramite trasfezione

Varianti di progettazione

CRISPR +/- HDR

• Gli gRNA codificati dal PAM CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m) e dal PAM CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m2) prendono di mira siti distinti all'interno del locus Pam. Potrebbe essere disponibile uno o entrambi i design di targeting. Vedere Prodotti correlati per la disponibilità.
  I costrutti donatori HDR codificati dal PAM Plasmide HDR (m) e il plasmide HDR PAM (m2) contengono una cassetta di resistenza alla puromicina e un reporter RFP affiancato da bracci di omologia Pam per supportare la riparazione diretta dall'omologia in siti bersaglio Pam definiti corrispondenti ai disegni CRISPR/Cas9 KO. La disponibilità dei donatori HDR può variare. Vedere Prodotti correlati per la disponibilità.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.