Plasmide CRISPR d'Activation (h) PAK4: sc-401895-ACT

PAK4 (p21-activated kinase 4) est une kinase sérine/thréonine qui agit en aval des GTPases Cdc42/Rac afin de coordonner le remodelage du cytosquelette, la polarité cellulaire et la dynamique d’adhérence. Elle module l’organisation de l’actine et le renouvellement des adhésions focales via la phosphorylation de substrats qui influencent la signalisation de la famille Rho, et elle s’interface avec des réseaux associés à MAPK et PI3K/AKT, affectant la survie et la motilité. Dans les cellules humaines, une activité ou une expression altérée de PAK4 a été associée à une prolifération dérégulée, à des phénotypes invasifs et à une résistance aux signaux de stress dans de multiples contextes pathologiques. Ces propriétés font de PAK4 un nœud utile pour étudier la signalisation des kinases, les programmes de migration/invasion et les réponses transcriptionnelles aux signaux issus du cytosquelette.

PAK4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PAK4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PAK4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PAK4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PAK4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PAK4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PAK4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PAK4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PAK4 dans les cellules tumorales présentant une expression de PAK4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.