PACE4 CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-405605-ACT-2

Das humane Gen PCSK6 kodiert die Proprotein-Konvertase PACE4, eine sekretierte und mit der extrazellulären Matrix assoziierte Serin-Endoprotease, die verschiedene Vorläuferproteine aktiviert, indem sie im sekretorischen Weg und an der Zelloberfläche paarige basische Aminosäurereste spaltet. PACE4 trägt zur Proteostase und zur interzellulären Signalübertragung bei, indem es Wachstumsfaktoren, Rezeptoren, Metalloproteinasen und Komponenten der extrazellulären Matrix prozessiert und dadurch Signalwege beeinflusst, die mit Entwicklung, Gewebeumbau und Zellmigration verknüpft sind. Eine dysregulierte PCSK6-/PACE4-Aktivität wurde mit veränderten proteolytischen Netzwerken bei der Tumorprogression, kardiovaskulären Merkmalen sowie in Kontexten entzündlichen oder fibrotischen Remodellings in Verbindung gebracht. Werkzeuge zur Geneditierung von PCSK6 und zur funktionellen Perturbation ermöglichen mechanistische Studien zur konvertaseabhängigen Substratreifung, zum Secretom-Profiling und zur Aufschlüsselung proteaseregulierter Signalkreisläufe in humanen Zellmodellen.

PACE4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PCSK6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PACE4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PCSK6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PCSK6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PACE4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PCSK6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PACE4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PACE4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PCSK6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.