p16-ARC CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403469-ACT

Das humane ARPC5 codiert p16-ARC, eine zentrale Untereinheit des Arp2/3-Komplexes, der verzweigte Aktinfilamente nukleiert und so die Bildung von Lamellipodien, Zellpolarität, Endozytose und vesikulären Transport steuert. Über die Regulation des Aktin-Remodelings downstream von GTPasen der Rho-Familie koordiniert die Arp2/3-Aktivität den Turnover von Adhäsionen und die gerichtete Migration und prägt damit die Zytoskelettdynamik während Proliferation und Differenzierung. Eine veränderte Funktion des Arp2/3-Komplexes und die Organisation des Aktinnetzwerks wurden in verschiedenen Krebszusammenhängen mit invasiven Phänotypen und metastatischem Verhalten in Verbindung gebracht sowie mit allgemeineren Defekten im Membrantransport und in der Motilität von Immunzellen. ARPC5 ist daher ein nützlicher Knotenpunkt zur Untersuchung zytoskelettabhängiger Signalwege, der Mechanotransduktion und mikroenvironmentgetriebener Veränderungen der Zellbewegung.

p16-ARC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ARPC5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

p16-ARC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ARPC5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ARPC5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen p16-ARC-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ARPC5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von p16-ARC-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des p16-ARC-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ARPC5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.