Orai1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400901-ACT

ORAI1 codifica Orai1, la subunità che forma il poro del canale del calcio attivato dal rilascio di calcio (CRAC), che media l’ingresso di calcio dipendente dalle scorte (SOCE) in seguito alla deplezione di Ca²⁺ del reticolo endoplasmatico. Consentendo un afflusso sostenuto di Ca²⁺, Orai1 regola programmi trascrizionali a valle dipendenti dal Ca²⁺, come la segnalazione di NFAT, modulando l’attivazione dei linfociti, la produzione di citochine e, più in generale, le funzioni effettrici delle cellule immunitarie. L’attività di ORAI1 influenza inoltre proliferazione, migrazione e secrezione in molteplici tipi cellulari attraverso vie sensibili al Ca²⁺ e reti di omeostasi ionica. Una segnalazione ORAI1/SOCE deregolata è stata associata a fenotipi di disfunzione immunitaria e a processi infiammatori patologici, supportandone l’impiego come nodo meccanicistico negli studi di segnalazione cellulare.

Orai1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ORAI1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Orai1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ORAI1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ORAI1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Orai1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ORAI1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Orai1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Orai1 nelle cellule tumorali con espressione di ORAI1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.