Plasmide CRISPR d'Activation (h) OBFC1: sc-405050-ACT

STN1 code OBFC1, une sous-unité centrale du complexe CST (CTC1–STN1–TEN1) qui se lie à l’ADN simple brin et coordonne la protection des extrémités télomériques avec les réponses au stress de réplication à l’échelle du génome. OBFC1 soutient la synthèse de comblement du brin C des télomères et favorise une progression correcte des fourches de réplication, contribuant à prévenir une accumulation excessive d’ADN simple brin et une signalisation aberrante des dommages à l’ADN. Via des interactions avec l’ADN polymérase α/primase et une interconnexion avec les voies de point de contrôle dépendantes d’ATR, OBFC1 participe à la reprise de la réplication et au maintien de la stabilité chromosomique. La dérégulation des composants du CST a été associée à des défauts de longueur des télomères, à une instabilité génomique accrue et à une susceptibilité à des troubles caractérisés par une réplication de l’ADN et un entretien des télomères altérés.

OBFC1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de STN1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

OBFC1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus STN1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription STN1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de OBFC1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus STN1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de OBFC1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie OBFC1 dans les cellules tumorales présentant une expression de STN1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.