OBFC1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405050-ACT

STN1 codifica OBFC1, una subunità fondamentale del complesso CST (CTC1–STN1–TEN1) che si lega al DNA a singolo filamento e coordina la protezione delle estremità dei telomeri con le risposte allo stress replicativo a livello dell’intero genoma. OBFC1 sostiene la sintesi di riempimento del filamento C del telomero e promuove una corretta progressione della forcella di replicazione, contribuendo a prevenire un accumulo eccessivo di DNA a singolo filamento e un’attivazione aberrante dei segnali di danno al DNA. Attraverso interazioni con la DNA polimerasi α/primasi e il crosstalk con le vie di checkpoint dipendenti da ATR, OBFC1 contribuisce al riavvio della replicazione e al mantenimento della stabilità cromosomica. La deregolazione dei componenti del CST è stata associata a difetti nella lunghezza dei telomeri, a un’aumentata instabilità genomica e a una maggiore suscettibilità a disturbi caratterizzati da replicazione del DNA e mantenimento dei telomeri compromessi.

OBFC1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di STN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

OBFC1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus STN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione STN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di OBFC1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus STN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da OBFC1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via OBFC1 nelle cellule tumorali con espressione di STN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.