Nur77 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-418320-ACT

NR4A1 kodiert den verwaisten nukleären Rezeptor Nur77, einen Immediate-Early-Transkriptionsfaktor, der extrazelluläre Signale rasch mit Genexpressionsprogrammen koppelt, die das Zellschicksal steuern. Nur77 integriert Signale nachgeschaltet von MAPK-, PI3K/AKT- und calciumabhängigen Signalwegen, um Apoptose, Proliferation und metabolische Anpassung zu regulieren, und kann über Crosstalk mit NF-κB und AP-1 inflammatorische Transkriptionsnetzwerke modulieren. In Immunzellen ist Nur77 ein zentraler Regulator der durch den T‑Zell‑Rezeptor ausgelösten Aktivierung, Toleranz und Differenzierung und beeinflusst dabei Zytokinprogramme und Stressantworten. Eine fehlregulierte NR4A1-Expression oder -Aktivität wurde mit entzündlichen Erkrankungen und der Krebsbiologie in Verbindung gebracht, was seine Nutzung als mechanistischen Knotenpunkt für signalwegfokussierte Forschung unterstützt.

Nur77 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NR4A1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Nur77 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NR4A1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NR4A1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Nur77-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NR4A1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Nur77-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Nur77-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NR4A1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.