NUDT21 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402082-ACT

Humanes NUDT21 kodiert eine zentrale Komponente des Cleavage Factor Im (CFIm)-Komplexes, der UGUA-Elemente auf prä-mRNA erkennt und die 3′-End-Prozessierung sowie die Wahl der Poly(A)-Stelle fördert. Durch die Regulation der alternativen Polyadenylierung prägt NUDT21 die Länge der 3′-UTR, die Transkriptstabilität, die Lokalisation und die translatorische Kontrolle und beeinflusst damit globale Genexpressionsprogramme. Diese Rolle in der RNA-Prozessierung verknüpft NUDT21 mit Signalwegen, die Zellzykluskontrolle, Differenzierung und Stressantworten steuern, indem die Nutzung von mRNA-Isoformen koordiniert moduliert wird. Eine dysregulierte CFIm-Aktivität und veränderte Muster der alternativen Polyadenylierung unter Beteiligung von NUDT21 wurden mit krankheitsrelevanten Transkriptionsumbauprozessen bei Krebs sowie mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen in Verbindung gebracht, was NUDT21 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien der posttranskriptionellen Regulation macht.

NUDT21 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NUDT21-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NUDT21 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NUDT21-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NUDT21-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NUDT21-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NUDT21-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NUDT21-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NUDT21-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NUDT21-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.