NPC2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402010-ACT

Humanes NPC2 kodiert ein lösliches lysosomales Cholesterin-bindendes Protein, das mit NPC1 zusammenarbeitet, um nicht verestertes Cholesterin und andere Lipide aus späten Endosomen/Lysosomen in nachgeschaltete Transportwege zu mobilisieren. Die NPC2-Aktivität unterstützt die zelluläre Sterolhomöostase, die Membranzusammensetzung und lipidabhängige Signalwege, indem sie den Cholesterinexport und dessen Verteilung zum endoplasmatischen Retikulum und zur Plasmamembran reguliert. Eine Störung des NPC2-abhängigen Transports führt zu einer lysosomalen Lipidakkumulation und beeinträchtigt die endolysosomale Funktion; dadurch wird NPC2 mit der Niemann-Pick-Krankheit Typ C2 sowie mit weiteren Signalwegen in Verbindung gebracht, die an Neurodegeneration und metabolischer Dysfunktion beteiligt sind. Als zentrale Komponente des intrazellulären Lipidtransports wird NPC2 häufig in Studien zu Mechanismen der Autophagie-Lysosomen-Dynamik, des vesikulären Transports und cholesterinregulierter Genexpressionsprogramme untersucht.

NPC2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NPC2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NPC2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NPC2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NPC2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NPC2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NPC2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NPC2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NPC2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NPC2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.