NPAS4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402373-ACT

Humanes NPAS4 (neuronal PAS domain protein 4) ist ein aktivitätsabhängiger basischer Helix-Loop-Helix-PAS-Transkriptionsfaktor, der neuronale Depolarisation und Kalziumsignalgebung mit schnellen transkriptionellen Programmen verknüpft. Es reguliert das Gleichgewicht zwischen exzitatorischer und inhibitorischer Aktivität, indem es Synapsenentwicklung und Plastizität moduliert, und integriert Signale aus CREB- und MAPK-assoziierten Signalwegen, um stimulusresponsive Gen-Netzwerke umzugestalten. NPAS4 beeinflusst das Remodeling neuronaler Schaltkreise, die Dynamik dendritischer Spines sowie stressresponsive Transkription und stellt damit einen zentralen Knotenpunkt der erfahrungsabhängigen Plastizität dar. Eine Fehlregulation der NPAS4-Expression und seiner nachgeschalteten Zielgene wurde mit neuropsychiatrischen und neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen in Verbindung gebracht, darunter veränderte Kognition sowie eine erhöhte Anfälligkeit für anfalls- und stressbezogene Veränderungen der Signalübertragung.

NPAS4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NPAS4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NPAS4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NPAS4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NPAS4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NPAS4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NPAS4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NPAS4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NPAS4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NPAS4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.