Nox4 CRISPR Activation Plasmid (r): sc-437338-ACT

NADPH-Oxidase 4 (Nox4) ist ein membranassoziiertes Flavocytochrom, das in Rattenzellen im Rahmen regulierter Redox-Signalwege reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzeugt, vor allem Wasserstoffperoxid. Von Nox4 abgeleitete ROS beeinflussen Signalwege, die Proliferation, Differenzierung, Zytoskelett-Umbau und den Umsatz der extrazellulären Matrix steuern, mit nachgeschalteten Effekten auf die MAPK-Signalübertragung, TGF-β-Antworten und hypoxieassoziierte transkriptionelle Programme. Eine veränderte NOX4-Aktivität wurde mit oxidativem Stress in Verbindung gebracht, der für Fibrose, vaskuläre Dysfunktion, Nierenschädigung und inflammatorische Signalgebung relevant ist, was NOX4 zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien des redoxabhängigen zellulären Umbaus macht. Da NOX4 in manchen Kontexten konstitutiv aktiv sein kann, wird die Modulation seiner Expression häufig genutzt, um zu untersuchen, wie eine anhaltende ROS-Produktion Signalnetzwerke umgestaltet.

Nox4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (r) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen -Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Nox4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (r) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des -Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der -Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Nox4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native -Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Nox4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Nox4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem -Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.