Plasmide CRISPR d'Activation (m) Notch 3: sc-421933-ACT

Le gène murin Notch3 code le récepteur Notch 3, un régulateur transcriptionnel transmembranaire à passage unique, activé par un clivage protéolytique dépendant du ligand et par la translocation nucléaire du domaine intracellulaire de Notch. Dans les cellules musculaires lisses vasculaires et les péricytes, la signalisation NOTCH3 contribue au contrôle des décisions de destinée cellulaire, de la maturation et de la stabilité des vaisseaux via la transcription canonique médiée par RBPJ et des interactions avec des voies telles que TGF-β, PDGFR et MAPK. Une activité Notch3 altérée est associée à des programmes de différenciation dérégulés et à des réponses de remodelage en biologie cardiovasculaire et neurovasculaire, et elle est aussi fréquemment étudiée dans des contextes de plasticité de lignée et de réseaux de signalisation des cellules tumorales. Par conséquent, Notch3 est une cible courante pour étudier la signalisation du développement, la communication cellule–cellule et les transitions d’état transcriptionnel dans des systèmes de modèles murins.

Notch 3 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Notch3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Notch 3 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Notch3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Notch3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Notch 3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Notch3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Notch 3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Notch 3 dans les cellules tumorales présentant une expression de Notch3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.