Plasmide CRISPR d'Activation (m) NOS2/iNOS: sc-421928-ACT

Le gène murin **Nos2** code la nitric oxide synthase inductible (**NOS2/iNOS**), une enzyme induite par l’inflammation qui catalyse la production d’oxyde nitrique à partir de la L-arginine, modulant l’équilibre rédox et la défense antimicrobienne. iNOS est régulée au niveau transcriptionnel en aval de la signalisation de l’immunité innée, notamment via NF-κB et les voies dépendantes des interférons, et contribue à la polarisation des macrophages ainsi qu’aux réseaux de cytokines. Une activité prolongée de NOS2 peut favoriser le stress nitrosatif, la S-nitrosylation des protéines et des dommages à l’ADN, reliant une signalisation de l’oxyde nitrique dérégulée aux lésions tissulaires inflammatoires et à des modifications de la biologie du microenvironnement tumoral. **Nos2** est largement utilisé comme lecture fonctionnelle de l’activation des cellules myéloïdes et comme nœud mécanistique reliant la stimulation immunitaire aux réponses métaboliques et au stress oxydatif.

NOS2/iNOS Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Nos2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NOS2/iNOS Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Nos2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Nos2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NOS2/iNOS. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Nos2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NOS2/iNOS au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NOS2/iNOS dans les cellules tumorales présentant une expression de Nos2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.