NOPAR CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409016-ACT

MED12L kodiert NOPAR, ein nukleäres Protein, das mit der Transkriptionskontrolle und der RNA-Polymerase-II-abhängigen Genregulation über Mediator-assoziierte Mechanismen in Verbindung steht. Durch die Beeinflussung der Enhancer-Promotor-Kommunikation und der Rekrutierung von Kofaktoren ist MED12L in der Lage, Zellzustandsprogramme wie Proliferation, Differenzierung und stressresponsive Transkription zu modulieren. Störungen von Komponenten der Mediator-Achse, einschließlich MED12L, werden wiederholt mit fehlregulierten Genexpressionsnetzwerken in Verbindung gebracht, wie sie bei Entwicklungsstörungen und verschiedensten Krebserkrankungen beobachtet werden, was seine Relevanz für mechanistische Studien zur Fehlregulation der Transkription unterstreicht. Die Untersuchung von MED12L/NOPAR ist daher nützlich, um regulatorische Schaltkreise zu kartieren und Genotyp-Phänotyp-Zusammenhänge in humanen Zellmodellen herzustellen.

NOPAR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MED12L-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NOPAR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MED12L-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MED12L-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NOPAR-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MED12L-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NOPAR-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NOPAR-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MED12L-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.