Plasmide CRISPR d'Activation (h) NOPAR: sc-409016-ACT

MED12L code pour NOPAR, une protéine nucléaire associée au contrôle transcriptionnel et à la régulation de gènes dépendante de l’ARN polymérase II via des mécanismes liés au complexe Mediator. En influençant la communication entre enhancers et promoteurs ainsi que le recrutement de cofacteurs, MED12L est susceptible de moduler des programmes d’état cellulaire tels que la prolifération, la différenciation et la transcription en réponse au stress. La perturbation de composants de l’axe Mediator, dont MED12L, est fréquemment associée à des réseaux d’expression génique dérégulés observés dans des troubles du développement et divers cancers, ce qui étaye sa pertinence pour des études mécanistiques de la dérégulation transcriptionnelle. L’étude de MED12L/NOPAR est donc utile pour cartographier les circuits de régulation et relier les relations génotype‑phénotype dans des modèles cellulaires humains.

NOPAR Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MED12L sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NOPAR Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MED12L dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MED12L, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NOPAR. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MED12L natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NOPAR au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NOPAR dans les cellules tumorales présentant une expression de MED12L silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.