Nkx-6.2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403584-ACT

NKX6-2 codifica il fattore di trascrizione homeobox Nkx-6.2, un regolatore che si lega al DNA in modo sequenza-specifico e contribuisce a controllare i programmi di impegno di linea e di maturazione nel sistema nervoso centrale in sviluppo. L’attività di Nkx-6.2 si integra con le reti di patterning e differenziamento neurale modulando cascate trascrizionali che determinano le decisioni di destino cellulare e l’espressione genica a valle. Nella biologia umana, un’alterata regolazione di NKX6-2 è rilevante negli studi sui processi di neurosviluppo e sui programmi genici associati alla mielinizzazione, in cui un cablaggio trascrizionale aberrante può perturbare gli stati di maturazione neuronale e gliale. In quanto regolatore trascrizionale nucleare, Nkx-6.2 viene spesso studiato nel mapping di pathway, nell’analisi delle tempistiche dello sviluppo e nelle analisi di reti regolatorie che collegano l’occupazione di promotori/enhancer al fenotipo.

Nkx-6.2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NKX6-2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Nkx-6.2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NKX6-2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NKX6-2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Nkx-6.2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NKX6-2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Nkx-6.2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Nkx-6.2 nelle cellule tumorali con espressione di NKX6-2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.