Plasmide CRISPR d'Activation (h) Nkx-2.2: sc-401844-ACT

NKX2-2 code le facteur de transcription à homéoboîte Nkx-2.2, un régulateur nucléaire qui contribue à spécifier le destin cellulaire et à maintenir, au cours du développement, des programmes transcriptionnels restreints à une lignée. Il est particulièrement bien caractérisé dans le système nerveux central et dans les compartiments endocrines du pancréas, où il coordonne la différenciation et la maturation en s’intégrant à des réseaux de domaines homéotiques et au contrôle épigénétique de l’expression génique. L’activité de NKX2-2 influence des processus de patterning développemental et des circuits régulateurs en aval qui façonnent l’engagement des progéniteurs, leur prolifération et leur différenciation terminale. Une expression dérégulée de NKX2-2 a été rapportée dans divers contextes pathologiques impliquant des états de différenciation altérés et des programmes transcriptionnels aberrants, ce qui en fait un nœud utile pour l’étude des circuits transcriptionnels du développement et de l’oncogenèse.

Nkx-2.2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NKX2-2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Nkx-2.2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NKX2-2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NKX2-2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Nkx-2.2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NKX2-2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Nkx-2.2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Nkx-2.2 dans les cellules tumorales présentant une expression de NKX2-2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.