NKCC2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401707-ACT

O SLC12A1 humano codifica o NKCC2 (cotransportador sódio/potássio/cloreto 2), um transportador da membrana apical que medeia a captação eletroneutra de Na⁺-K⁺-2Cl⁻ em células epiteliais, com maior destaque no ramo ascendente espesso do néfron. Ao acoplar o transporte de cloreto aos fluxos de sódio e potássio, o NKCC2 sustenta a reabsorção transepitelial de sal e contribui para o equilíbrio osmótico e para o manejo tubular de eletrólitos. A atividade do NKCC2 interage com programas de homeostase iônica regulados pela sinalização de cAMP/PKA, pelas vias de quinases WNK–SPAK/OSR1 e por processos de tráfego de membrana que ajustam a abundância do transportador na superfície celular. Alterações na função de SLC12A1/NKCC2 estão implicadas em tubulopatias hereditárias com perda de sal e são amplamente estudadas no contexto da fisiologia renal, de distúrbios eletrolíticos e dos mecanismos de resposta a diuréticos.

NKCC2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC12A1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NKCC2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC12A1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC12A1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NKCC2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC12A1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NKCC2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NKCC2 em células tumorais com expressão de SLC12A1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.