NIRF CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403908-ACT

UHRF2 kodiert NIRF, ein multidomäniges nukleäres Protein, das E3-Ubiquitin-Ligase-Aktivität mit der Erkennung von methylierter DNA und Histonmarkierungen verknüpft, um die epigenetische Regulation zu koordinieren. Über seine Ubiquitin-ähnliche Domäne sowie PHD- und RING-Domänen trägt NIRF zum Chromatin-Remodeling, zur Aufrechterhaltung der DNA-Methylierung und zur zellzyklusgekoppelten Steuerung von Transkriptionsprogrammen bei. Diese Funktionen verbinden UHRF2 mit Signalwegen, die Genomstabilität, DNA-Schadensantworten und die Kontrolle der Proliferation regulieren, und machen es relevant für Studien zu aberranten epigenetischen Zuständen bei Krebs und anderen Erkrankungen mit gestörter Chromatinregulation. Eine veränderte UHRF2/NIRF-Aktivität wurde mit Änderungen in Promotor-Methylierungsmustern sowie mit transkriptioneller Stilllegung oder Aktivierung von Genen in Zusammenhang gebracht, die an onkogener Transformation und Differenzierung beteiligt sind.

NIRF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen UHRF2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NIRF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des UHRF2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der UHRF2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NIRF-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native UHRF2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NIRF-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NIRF-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem UHRF2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.