Plásmido CRISPR de Activación (h) Neurofibromin: sc-400625-ACT

NF1 codifica la neurofibromina, un gran supresor tumoral citoplasmático que actúa principalmente como una proteína activadora de la GTPasa de Ras (Ras-GAP), acelerando la conversión de Ras-GTP activo a Ras-GDP inactivo. A través de esta regulación negativa, la neurofibromina modula las vías de señalización MAPK/ERK y PI3K–AKT, determinando la proliferación, la diferenciación y las respuestas al estrés en múltiples tipos celulares. NF1 también se relaciona con la señalización de cAMP/PKA y con programas del citoesqueleto que influyen en la migración celular y en la biología de las neuritas. Las alteraciones con pérdida de función en NF1 se asocian con una salida desregulada de la vía de Ras y se estudian ampliamente en contextos del neurodesarrollo y del cáncer, lo que convierte a NF1 en un nodo central para la investigación de mecanismos de vías de señalización.

Neurofibromin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de NF1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Neurofibromin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus NF1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional NF1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Neurofibromin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo NF1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Neurofibromin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Neurofibromin en células tumorales con expresión de NF1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.