Particules Lentivirales d'Activation (h) NEDD8: sc-417924-LAC

NEDD8 code la protéine 8 exprimée dans les précurseurs neuronaux et réprimée au cours du développement (neural precursor cell expressed developmentally downregulated protein 8), un modificateur de type ubiquitine qui est conjugué à des cibles via la cascade de neddylation (E1 NAE1/UBA3, E2 UBE2M/UBE2F et ligases E3). La conjugaison de NEDD8 est un régulateur central des ligases ubiquitine culline‑RING, en favorisant le renouvellement, dépendant de l’ubiquitine, de protéines qui contrôlent la progression du cycle cellulaire, la réplication de l’ADN, les réponses au stress et la transduction du signal. En ajustant la protéostasie et le contrôle des checkpoints, NEDD8 influence des voies liées à la stabilité du génome et à la signalisation inflammatoire. Une neddylation dérégulée a été associée à des programmes de prolifération altérés et à des réseaux anormaux de dégradation des protéines observés dans de multiples états cellulaires pertinents pour les maladies.

Les particules d'activation lentivirales NEDD8 (h) répondent à ce besoin en encapsulant le système complet d'activation transcriptionnelle SAM (Synergistic Activation Mediator) dans des particules lentivirales à titre élevé prêtes à la transduction, permettant une régulation à la hausse efficace de NEDD8 dans un plus large éventail de types de cellules humaines.

Les particules d'activation lentivirales NEDD8 (h) délivrent tous les composants fonctionnels du système médiateur d'activation synergique (SAM) via la transduction lentivirale. Le système comprend trois préparations de particules co-transduites dans les cellules cibles : l'une codant pour une dCas9 catalytiquement inactive (mutations D10A et N863A) fusionnée au domaine de transactivation VP64 avec un gène de résistance à la blasticidine ; une codant pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1 avec un gène de résistance à l'hygromycine ; et une codant pour un ARNsg de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 avec un gène de résistance à la puromycine. Après transduction lentivirale et intégration génomique des cassettes d'expression, les composants du SAM sont exprimés de manière stable et s'assemblent au locus cible dans la région promotrice proximale en amont du site de départ de la transcription NEDD8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de manière coopérative pour recruter l'appareil transcriptionnel endogène et induire une régulation à la hausse soutenue de l'expression endogène de NEDD8. L'utilisation de dCas9 inactif sur les nucléases évite l'introduction de cassures double brin de l'ADN et préserve le locus génomique natif NEDD8 ainsi que l'architecture régulatrice.

Le format lentiviral offre plusieurs avantages pratiques : l'intégration génomique stable permet une activation héréditaire au fil des divisions cellulaires ; les préparations de particules à titre élevé éliminent le besoin d'une production virale en interne ; et la compatibilité avec les types de cellules primaires, non divisibles et résistantes à la transfection élargit l'accessibilité expérimentale. Le succès de la transduction peut être confirmé et renforcé par une triple sélection antibiotique utilisant la puromycine, l'hygromycine et la blasticidine.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.