Plasmide CRISPR d'Activation (h) NECAP 2: sc-409444-ACT

NECAP2 code pour NECAP 2, une protéine adaptatrice de l’endocytose enrichie dans le trafic médié par la clathrine, qui se lie à AP‑2 et à des facteurs accessoires afin de coordonner la maturation des puits recouverts et le décapage des vésicules. Par ses interactions avec des modules apparentés à FCHo/Eps15 et des circuits de régulation d’AP‑2, NECAP 2 influence la sélection des cargaisons, l’internalisation des récepteurs et les dynamiques de recyclage qui façonnent la transduction du signal à la membrane plasmique. Ces processus recoupent des voies contrôlant le renouvellement des récepteurs aux facteurs de croissance, le remodelage des membranes synaptiques et neuronales, ainsi que les réponses au stress cellulaire liées à un déséquilibre du trafic. Les altérations de l’endocytose et de la fonction des protéines adaptatrices sont fréquemment étudiées en biologie du cancer et en neurobiologie en raison de leur impact sur la disponibilité des récepteurs, l’amplitude de la signalisation et l’homéostasie membranaire.

NECAP 2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NECAP2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NECAP 2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NECAP2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NECAP2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NECAP 2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NECAP2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NECAP 2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NECAP 2 dans les cellules tumorales présentant une expression de NECAP2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.